Пилотное исследование репаративной регенерации костной ткани панциря молодых особей Trachemys scripta

План строения скелета черепах является эволюционной новинкой развития в связи с формированием специфичного для черепах панцирного гребня, индуцирующего рост рёбер в дорсальном направлении с последующим формированием некоторых пластин экзоскелета. Костные части панциря этих рептилий имеют различный гистогенез: невральные и костальные пластины развиваются по механизму непрямого остеогенеза в виде перихондрального окостенения элементов осевого скелета (позвонков и рёбер); периферальные пластины и пластрон развиваются по механизму прямого остеогенеза в дерме кожи — это так называемые «кожные кости», являющиеся производными отдельных остеогенных клеток за пределами осевого скелета и развивающиеся путем интрамембранного остеогенеза.

Проведён эксперимент по изучению посттравматического остеогенеза костных пластин карапакса пресноводных черепах Trachemys scripta 3-месячного возраста. Сформировано 2 дефекта костальных пластин карапакса диаметром 4 мм и глубиной до фасции с дальнейшим рутинным гистологическим исследованием. Установлено, что уже на 90 сутки костная ткань карапакса черепах восстанавливается с формированием полноценного костного регенерата по механизму первичного остеогенеза.

Введение

Скелет черепах характеризуется тем, что их рёбра не замыкаются вентрально, а растут в дорсальном направлении и формируют карапакс. К нему с боковой стороны примыкает пластрон (брюшной щит), формируя полноценный панцирь. Это происходит за счёт индуктивного влияния специфичного для черепах мезенхимноэктодермального утолщения — панцирного гребня (рис. 1), направляющего рост рёбер латерально, в отличие от других тетрапод, рёбра которых отклоняются вентрально с образованием замкнутой грудной клетки [1]. При этом плечевой пояс черепах оказывается инкапсулированным в полость тела.

Анализ РНК в области панцирного гребня на ранних стадиях развития выявил сходство в экспрессии генов и транскриптоме между панцирным гребнем и апикальным эктодермальным гребнем — зачатком будущей конечности позвоночных [2–4]. При формировании панцирного гребня выявлена экспрессия уникальных для него генов LEF-1, APCDD1, CRABP-I и Sp5 [2]. Однако клетки панцирного гребня не экспрессируют FGF8 — ген, выполняющий ключевую роль в развитии конечностей позвоночных [5].

Панцирь большинства черепах на различных этапах онтогенеза состоит из 2 элементов: дорсально расположенного карапакса и вентрального пластрона, соединенных между собой боковыми перемычками. Спинной щит представлен так называемыми невральными и костальными пластинами, по бокам к ним примыкают периферальные пластины с образованием карапакса. Пластрон состоит из четырёх парных и одной непарной костной пластины. Поверхность костных пластин покрыта роговыми щитками, представленными многослойным плоским ороговевающим эпителием.

Регенерация «кожных костей» остаётся малоисследованной, но важной для изучения закономерностей эволюционного развития костной ткани. Этот вопрос представляет интерес и с практической точки зрения, так как кости свода черепа человека формируются как отдельные остеогенные дермальные клетки. Первое и единственное доступное исследование репаративной регенерации костной ткани карапакса черепах осуществил Е.С. Данини в 1946 году, выполнив дефект костальных пластин у пресноводной черепахи Emys orbicularis [6].

Цель исследования: изучение посттравматической регенерации костной ткани карапакса молодых пресноводных черепах Trachemys scripta.

Материал и методы

В эксперимент включены 5 пресноводных красноухих черепах Trachemys scripta в возрасте 3 месяцев (диаметр карапакса 4 см). Черепахи содержались в аквариуме при температуре воды 24–26 °С. При помощи бора нанесено 2 полнослойных дефекта костальных пластин карапакса диаметром 4 мм на глубину до фасции (рис. 2). Тканевой материал для изучения забирали через 15, 30, 60 и 90 суток. Для гистологического исследования выпиливали участок дефекта, после декальцинации и рутинной пробоподготовки окрашивали гематоксилином и эозином.

Результаты

Через 15 суток после повреждения отчётливо заметна граница между зоной некроза с клеточным детритом и граничащей с ней рыхлой волокнистой соединительной тканью дна раны, содержащей большое число кровеносных сосудов с утолщенной стенкой (рис. 3А). Клеточные элементы соединительной ткани представлены преимущественно фибробластами; макрофагально-лейкоцитарной реакции не обнаружено, что свидетельствует о переходе процесса из фазы воспаления в фазу регенерации. Грануляционная ткань низко васкуляризована.

На 30 сутки от начала эксперимента продолжается отторжение поверхностного некротизированного участка и эпителизация раневого дефекта, под которым располагается слой рыхлой волокнистой соединительной ткани (рис. 3Б). Признаков регенерации костной ткани не обнаружено. Эпидермис утолщен и представлен крупными овальными и вытянутыми эпителиальными клетками с гиперхромными ядрами. В раневом дефекте находятся в основном клетки фибробластического дифферона, межклеточное вещество хорошо развито.

Через 60 суток дефект снаружи полностью покрыт многослойным плоским ороговевающим эпителием под которым располагается слой плотной волокнистой соединительной ткани с неупорядоченным направлением волокон межклеточного матрикса (рис. 3В). Со стороны стенок костного дефекта визуализируется формирование трабекул ретикулофиброзной костной ткани (не показано).

Спустя 90 суток дефект во всём объёме представлен грубоволокнистой костной тканью, четко визуализируются костные трабекулы с остеоцитарными лакунами и кровеносными сосудами (рис. 3Г). Кость покрыта слоем плотной волокнистой соединительной ткани с более упорядоченным направлением волокон, снаружи от которой лежит утолщенный многослойный плоский ороговевающий эпителий. Необходимо отметить, что процесс репаративной регенерации не прекращается на изученном этапе.

Обсуждение

С эволюционной точки зрения первая костная ткань была сформирована именно в кожном экзоскелете, появившись (по имеющимся данным) в Ордовикский период у вымерших птераспидоморфов в виде аспидина — бесклеточного костного вещества из ткани дентиноидного типа и прилегающей сверху эмали [7]. По мере эволюции организмов отчетливо заметна тенденция к постепенной редукции дентинового слоя и его замена грубоволокнистой костной тканью [8]. Уже у амфибий покровная дентиноподобная ткань почти отсутствует, её редукция сменяется другим процессом, а именно прогрессивным развитием эволюционно самой молодой — пластинчатой костной ткани с характерным остеонным устройством, достигающим своего наибольшего развития в классе млекопитающих [8].

Вопрос гистогенеза составляющих панцирь черепах костных пластин был предметом дискуссий [9–13]. В настоящее время доказано, что невральные и костальные пластины образуются по механизму непрямого остеогенеза в виде перихондрального остеогенеза элементов осевого скелета — позвонков и рёбер [14, 15]. Периферальные и костные пластины пластрона развиваются путём прямого остеогенеза в виде интрамембранного окостенения в дермальном слое кожи [15, 16].

До сих пор не решён вопрос, какой именно клеточный пул преимущественно участвует в гистогенезе пластральных костей. Одни авторы утверждают, что пластрон Trachemys scripta формируется путем миграции клеток стволовой части нервного гребня. В качестве доказательств приводятся иммуногистохимические данные по выявлению белков HNK-1, FoxD3, p75, Runx2, Twist, Msx2 и Sox10, характерных для клеток нервного гребня [17–20]. При этом клетки краниальной части нервного гребня, участвующие в формировании костей черепа человека, экспрессируют такие же белки [21, 22]. Однако такое же исследование у мягкотелой черепахи Pelodiscus sinensis не выявило клеток HNK-1+ [23]. Кроме того, известно, что HNK-1 обнаружен и в субпопуляции лимфоцитов человека — натуральных киллерах, то есть его экспрессия не является патогномоничным маркером клеток нервного гребня.

Опыты Е.С. Данини (1946) с регенерацией костальных пластин панциря у пресноводной черепахи Emys orbicularis длились около 225 дней и за этот срок образования полноценной кости не было обнаружено. До 75 дня после повреждения автор наблюдал процесс активного разрушения костной ткани остеокластами и эпителизацию раны, затем начинался медленный остеогенез с образованием небольшого количества грубоволокнистой костной ткани непосредственно на концах костных трабекул. Итогом работы стало заключение о том, что «размах регенерации кости у черепахи очень небольшой» [6], костная ткань не восстанавливается даже к 225 суткам, когда регенерация прекращается вовсе, что автор связывает с формированием плотной волокнистой соединительной ткани — рубцовой, и периодом спячки у черепах.

Интенсивность регенерации костной ткани зависит от нескольких условий. Ключевым является доступность и развитие кровеносных сосудов в области дефекта [24– 26]. Черепахи являются хладнокровными животными, а следовательно их метаболизм и кровоснабжение зависят от условий внешней среды, особенно от температуры. Поэтому выбран оптимальный для красноухих черепах температурный режим. Помимо этого, на интенсивность репаративных процессов влияют возраст [27] и доступность УФ-излучения [28].

В результате эксперимента установлено, что костная ткань карапакса молодых пресноводных черепах Trachemys scripta обладает способностью к посттравматической регенерации с восстановлением исходной структуры. Учитывая различный гистогенез слагающих панцирь костей, представляется интересным оценить их регенерацию в зависимости от гистогенеза, в частности изучить регенераторный потенциал так называемых «кожных костей» (пластральные и периферальные пластины). Помимо фундаментального, теоретического значения, этот вопрос имеет под собой конкретное практическое применение — кости свода черепа человека имеют такие же дермальные окостенения, поэтому дальнейшее гистологическое и генетическое изучение их регенерации создаёт предпосылки для клеточной и генной терапии краниофациальных заболеваний и индукции репаративного остеогенеза. Для этого необходим более глубокий анализ эмбриологических данных о клеточных популяциях, их дифференцировке, миграции и будущей судьбе.

Р.В. Деев, П.С. Подлужный, С.С. Гальков, А.В. Чернораев
Северо-Западный государственный медицинский университет им.И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия

Гены и клетки, 2020

Источник и PDF cyberleninka.ru